草铵膦（Phosphinothricin，PPT），是一种有机磷类除草剂（basta的活性成分），其有效成分是膦丝菌素（PPT）。

 

草铵膦主要通过抑制谷氨酰胺合成酶（GS）活性，使植物体内氮代谢紊乱、细胞内氨的含量过高而中毒、叶绿素解体、 

 

光合作用受到抑制，最终导致植物死亡。

 

谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内唯一能降解氨毒的酶，能够去除植物体内因硝酸还原反应、氨基降解反应和光呼吸

 

反应过程所释放的氨。 

草铵膦乙酰转移酶基因Bar，从土壤吸水链霉菌中分离克隆而来，其编码的草铵膦乙酰转移酶（PAT）对草铵膦专一性高，

 

它可以催化PPT的自由氨基乙酰化，使PPT不能抑制GS的活性，含有该基因的植物具有对Basta的抗性。

 

利用Basta筛选转基因植物主要有两种方法。一种是在幼苗长出叶片之后直接向待筛选植株喷施Basta，另一种是在MS培养基

 

中加入适当浓度的Basta。培养皿中央点野生型种子作为对照，其余部分点突变体种子，水平放置培养。

 

挑选发芽较好的幼苗，移栽到土壤中作为候选突变体培养。不同的植物对于Basta的敏感程度不同，同一植物不同生长阶段

 

对于Basta的敏感程度也不同。临界筛选浓度的判定标准：以野生型几乎不能发芽或者发芽不能存活的basta浓度。

 

根据拟南芥幼苗的黄化程度和死亡率确定出basta最佳筛选浓度。

10%Basta 除草剂（CB2471）即为含量10%的草铵膦溶液，使用时用去离子水稀释，筛选植株喷施一般工作浓度为0.001-0.002%

应用案例(转基因的小麦幼胚/愈伤组织筛选

1.使用草铵膦(PPT)或双丙氨膦进行转化细胞的筛选

2.粒子轰击(bombardment)后将未成熟幼胚逐个转移到E3培养基,维持培养14天

3.胚胎转移到含5ug/ml PPT(或双丙氨膦)的MSCB5培养基(第一轮筛选用培养基),黑暗培养二周;

 

  而这二周内不能正常生长的愈伤组织扔弃

4.用解剖刀将在MSCB5培养基上增值的细胞簇解离,亚克隆,转移到含10ug/ml PPT(或双丙氨膦)的MSCB10培养基, 维持培养4周

5.在含5ug/ml PPT或10ug/ml PPT(或双丙氨膦)的培养基上筛选过程的持续周期约50-75天,将所有培养物放到植物生长培养箱

 

  内,设置25度,黑暗培养,每一个转基因愈伤组织在含有筛选标的培养基上最终生长为大量的胚胎愈伤组织

6.设置1-10ug/ml PPT(或双丙氨膦)的梯度浓度来测试未转化愈伤组织,以建立更加有效的筛选系统,每一次实验大概准备20个

 

  目标培养平板,2各为对照,1个在N6C1上生长以监测培养物的健康情况,另一个在含5-10ug/ml双丙氨膦的N6C1上生长以验证

 

  未转化细胞对选择标志的反应

 

注意：

转基因小麦愈伤组织的选择实验中双丙氨膦是有效的筛选标志，然而双丙氨膦不能杀死未转化细胞。

 

为了得到理想的筛选效果，建议低密度（大概每个平板上10个未成熟幼胚）亚培养粒子轰击后的细胞。